|
DNA测序方法是指分析特定DNA片段的碱基序列，即腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）的排列方式的技术。以下是几种常见的DNA测序方法： 一、传统测序方法双脱氧链末端终止法（Sanger测序法） - 由英国生化学家弗雷德里克·桑格尔发明，是目前应用最广泛的测序方法之一。
- 原理是利用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。
- 产生的DNA片段具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，然后用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测，从而获得DNA序列。
化学降解法 - 由Maxam和Gilbert发明，与Sanger测序法在原理上差异很大，但同样是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸。
- 然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。
二、高通量测序方法随着技术的发展，高通量测序方法逐渐兴起，这些方法能够同时测定大量的DNA序列，大大提高了测序效率。 第二代测序技术 - 以循环阵列合成测序法为代表，通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号来间接确定序列。
- 这种方法需要昂贵的光学监测系统，并要记录、存储并分析大量的光学图像，增加了仪器的复杂性和成本。
第三代测序技术 - 代表技术为直接测序法，将基因组DNA随机切割成片段，制成单链并与六寡聚核苷酸探针杂交。然后驱动结合了探针的基因组文库片段通过可寻址的纳米孔阵列，通过每个孔的离子电流均可独立测量，追踪电流的变化来确定探针杂交在每个基因组片段上的精确位置。最后利用基因组片段上杂交探针的重叠区域将基因组片段文库排列起来，建立一组完整的基因组探针。
- 这种方法不需要使用化学试剂，有望进一步降低测序成本。
三、特定应用场景的测序方法全基因组测序（WGS） - 把物种细胞里面完整的基因组序列从第一个DNA开始一直到最后一个DNA，完完整整地检测出来并排列好。能够鉴定出基因组上几乎任何类型的突变。
全外显子测序（WES） - 针对基因组中的外显子区域进行测序，外显子是基因中编码蛋白质的序列部分。这种方法能够更高效地筛选出与遗传疾病相关的基因突变。
靶向DNA测序 - 针对特定的基因或基因组区域进行测序。这种方法通常用于研究特定的遗传疾病或基因功能。
单细胞测序 - 在单细胞层面进行基因组测序，能够揭示细胞间的异质性。这对于研究发育生物学、肿瘤学等领域具有重要意义。
甲基化测序 - 针对DNA甲基化修饰进行测序，甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式。甲基化测序能够揭示基因表达调控的机制，对于研究疾病的发生和发展具有重要意义。常见的甲基化测序技术包括全基因组DNA甲基化测序（WGBS）、简化基因组甲基化测序（RRBS）等。
| 
发表于 2024-10-31 09:37:05
