流式细胞仪校准规范

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　　流式细胞仪的校准规范是确保实验结果准确性的重要步骤，其规范通常涵盖多个方面，以下是对流式细胞仪校准规范的详细归纳：
　　一、校准适用范围
　　基于荧光检测原理的分析型流式细胞仪的校准应参考相关规范执行，其他类型的流式细胞仪可参照执行。
　　二、校准条件
　　环境温度：应控制在（15~30）℃。
　　相对湿度：室内相对湿度应≤70%。
　　三、校准设备
　　校准设备需经检定合格，且应包括以下标准物质和化学试剂：
　　标准物质
　　单一荧光强度的荧光微球标准物质：用于分辨力校准。
　　多重荧光强度混合荧光微球标准物质：用于线性相关系数校准。
　　计数荧光微球标准物质。
　　淋巴细胞计数标准物质：用于重复性+示值误差校准。校准时应采用有证标准物质，相对扩展不确定度不超过20%（k=2）。
　　化学试剂
　　去离子水：电阻率为18.2MΩ·cm，且需经0.22μm滤膜过滤。
　　磷酸钠缓冲液：0.1mol/L，pH值控制在7.2~7.4范围内。
　　移液器：量程为（200~1000）μL，且需达到B级及以上标准。
　　四、校准项目与方法
　　外观检查：采用目测、手动法进行检查。
　　分辨力校准
　　仪器预热至正常工作状态。
　　在装有0.5mL经0.22μm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中，加入0.5mL单一荧光强度的荧光微球标准物质，混匀后上机实验。
　　记录前向角散射光和488nm激发下两个荧光通道（绿色荧光FITC、橙红色荧光PE）的信号。
　　收集门内有效信号10000个，计算前向角散射光和两个荧光通道中校准微球峰宽的相对标准偏差，即为分辨力。
　　线性相关系数校准
　　在装有1mL经0.22μm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中，加入20μL多重荧光强度混合荧光微球标准物质，混匀后上机实验。
　　记录488nm激发下绿色荧光（FITC）、橙红色荧光（PE）通道信号。
　　对试验结果进行直方图分析，得到每个峰的平均荧光强度。
　　根据校准微球标准物质证书提供的各个峰的等量可溶性荧光分子（MESF），将各峰的MESF取对数lg(MESF)，简化表示为y；各峰测量的平均荧光强度取对数lg(FITC)或lg(PE)，简化表示为x。将两者线性回归得到方程y=kx+b，计算两个通道的线性相关系数（r）。
　　检出限校准
　　针对绿色荧光（FITC）和橙红色荧光（PE）荧光通道，采用线性相关系数校准中得到的线性回归方程y=kx+b。
　　计算无荧光标记的空白微球的平均荧光强度值对应的MESF，即为荧光检出限（LOD）。
　　漂移校准
　　将周围环境温度控制在允许范围内（设定温度±3℃）。
　　在装有1mL经0.22μm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中，加入数滴单色荧光微球标准物质，混匀后上机试验。
　　记录前向角散射光和488nm激发下绿色荧光（FITC）、橙红色荧光（PE）通道的信号，收集10000个以上门内有效信号。
　　测试完成后，利用直方图分析试验结果，计算标准微球的平均荧光强度值。
　　连续开机2小时后，在相同流式细胞仪设置和荧光通道电压值的条件下重复前述试验步骤，得到新的平均荧光强度值。
　　计算相对漂移率来表示稳定性。
　　重复性校准
　　取100μL淋巴细胞标准物质，按比例添加抗原决定簇CD4抗体，轻柔涡旋充分混匀后避光存放半小时，使CD4抗体与细胞充分结合。
　　标记好CD4抗体后上机测试，收集10000个以上门内有效信号。
　　重复测量6次，依次记录每次测量的CD4阳性细胞占总淋巴细胞的百分比。
　　计算CD4阳性细胞数量占总淋巴细胞的百分比的相对标准偏差（RSD），作为重复性的评价。
　　示值误差校准
　　按照重复性校准实验中得到的CD4阳性细胞占总淋巴细胞的百分比计算平均值。
　　然后计算示值误差，最后评估示值误差校准不确定度。
　　五、校准结果表达
　　校准结果应包含各项校准项目的具体数值和结论，如分辨力、线性相关系数、检出限、漂移率、重复性等的具体数值和是否合格等结论。
　　六、复校时间间隔
　　建议不超过一年进行复校，以确保流式细胞仪的准确性和稳定性。
　　七、安全操作与保养
　　在操作流式细胞仪时，需要做好安全防护措施，如佩戴防护眼镜、手套等。
　　对样品进行处理前，应先进行消毒处理。
　　在进行样品注入时，应进行过滤和细胞计数，控制加入的细胞数量。
　　遵守严格的操作规程，避免将手伸入仪器内部或进行不当操作。
　　定期对仪器进行内部清洁和校准，更换滤网和试剂等易损件。
　　仪器应放置在适宜的环境下工作，避免过高或过低的温度和湿度对仪器造成影响。
　　综上所述，流式细胞仪的校准规范涵盖了多个方面和细节问题。只有严格按照规范进行校准和操作，才能确保流式细胞仪的准确性和稳定性，为科研和临床提供可靠的数据支持。