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微生物限度检测是评估药品、食品等产品中微生物污染程度的重要方法，其操作步骤需严格遵循无菌原则和标准化流程。以下是综合多个来源的核心操作步骤及技术要点：
一、前期准备环境与设备 - 检测需在万级洁净室内的百级层流超净工作台进行，定期验证环境沉降菌（≤1 CFU/皿）和压差。
- 仪器（如微生物限度检测仪、离心机）及玻璃器皿（平皿、吸管等）需提前灭菌处理。
试剂与培养基 - 配制稀释液（如pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液）及培养基（营养琼脂、玫瑰红钠琼脂等），经121℃高压灭菌后备用。
人员与防护 - 操作者需穿戴无菌服、口罩、手套，手部用75%乙醇消毒，实验过程中严格避免交叉污染。
二、样品处理取样要求 - 随机抽取≥3倍检验量的样品，固体取10g、液体取10ml，膜剂需≥4片或100cm²。
供试液制备 - 常规样品：固体研磨后加稀释液制成1:10供试液；液体直接稀释或原液检测。
- 特殊样品：
- 油脂类：加入无菌十四烷酸异丙酯或聚山梨酯80乳化后稀释。
- 抑菌性样品：采用薄膜过滤法（如抗生素类）或中和剂处理。
三、接种与培养细菌/霉菌计数 - 平皿法：取供试液1ml注入无菌平皿，倾注45℃以下融化的培养基（营养琼脂用于细菌，玫瑰红钠琼脂用于霉菌/酵母菌），摇匀后凝固培养。
- 薄膜过滤法：供试液经滤膜过滤后冲洗（总冲洗量≤1000ml），滤膜贴于培养基表面培养，适用于抑菌性样品。
控制菌检查 - 如大肠埃希菌、沙门氏菌等，采用增菌培养（胆盐乳糖培养基）→分离培养（选择性琼脂）→生化鉴定的步骤。
培养条件 - 细菌：30-35℃培养3-5天；霉菌/酵母菌：23-28℃培养5-7天。
四、结果观察与分析菌落计数 - 使用菌落计数器或显微镜观察，记录各稀释级的菌落数，以平均菌落数计算CFU/g或CFU/ml。
控制菌判定 - 阳性对照需检出目标菌，阴性对照无菌生长，否则实验无效。
五、方法学验证回收率试验 - 加入标准菌株（如金黄色葡萄球菌、黑曲霉），验证样品抑菌性是否消除，回收率需≥70%。
方法选择依据 - 根据样品特性选择常规法、培养基稀释法或薄膜过滤法，确保检测结果准确。
六、注意事项- 实验全程需无菌操作，避免二次污染。
- 抑菌性样品需优先采用薄膜过滤法或离心集菌法处理。
- 定期对培养基进行适用性检查（如促生长试验）。
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