流式细胞仪的电压和增益参数优化

慧仪仪器

优化流式细胞仪的电压和增益参数是确保信号检测准确性和实验可重复性的关键步骤。以下是详细的操作指南：  
​一、理解电压和增益的作用  
​电压：调节光电倍增管的灵敏度，影响信号放大倍数。电压过高会导致信号饱和（过曝），过低则无法检测弱信号。  
​增益：部分仪器通过增益调整信号放大倍数，与电压配合使用，确保信号在检测器的线性动态范围内。  
​二、优化参数的准备工作  
​样本准备  
​阴性对照：未染色的细胞或同型对照，用于确定背景信号。  
​阳性对照：明确表达目标抗原的细胞，用于验证信号强度。  
​校准微球：如荧光微球，用于标准化仪器性能。  
​仪器预热  
开机后预热30分钟，确保激光器和液流系统稳定。  
​三、分步优化电压和增益  
​步骤1：初始参数设定  
使用仪器默认电压或历史实验的合理参数作为起点。  
若首次使用，参考仪器手册或校准微球说明书推荐值。  
​步骤2：调整前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）​  
运行阴性对照样本，观察FSC和SSC的分布。  
调节FSC和SSC的电压，使细胞群集中在散点图中央（避免信号超出坐标轴）。  
​目标：细胞群清晰可见，碎片和噪音信号被阈值过滤。  
​步骤3：优化荧光通道电压  
​单色样本法：  
分别运行单个荧光标记的阳性样本。  
调节对应通道的电压，使阳性信号峰值位于对数坐标的中间偏右（如10³~10⁴区间）。  
阴性对照信号应集中在左侧（接近10⁰）。  
​电压滴定法​（推荐）​：  
使用同一阳性样本，逐步增加电压（如每次增加50V），记录信号分布。  
选择使阳性与阴性信号分离最佳且无饱和的**电压。  
​步骤4：验证多色实验的兼容性  
运行多色混合样本，检查荧光渗漏（补偿问题）。  
若补偿后仍有干扰，可能需要微调电压或更换光谱重叠较少的染料组合。  
​步骤5：使用校准微球标准化  
运行校准微球（如8峰微球），确保各荧光通道的电压使微球信号峰均匀分布。  
记录标准化参数，便于后续实验重复。

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这个问题我也遇到过，后来这样解决的...